Biotechnológia
Géntechnológia és fehérjemérnökség
Molekuláris biológia / Biotechnológia
Bevezetés a biokémiába gyakorlati jegyzet
Új molekuláris biológiai módszerek
Laboratóriumi gyakorlatok
Molekuláris biológiai módszerek - gyakorlatok középiskolásoknak
Saját gyakorlat
Biokémia gyakorlati jegyzet
HSDR4
Bioinformatika
Saját anyagok
NCBI_Search
Uniprot
Virtuális laborgyakorlatok
https://www.asbmb.org/education/online-teaching/online-lab-work
https://www.labxchange.org/library
1) "Biotechnológia" demonstráció - agaróz gél elektroforézis
Nincs vektorunk (Lambda fág) - helyette HIND iii restrikciós enzimmel hasított lambda fágot használunk http://www.biotools.eu/documentospdf/LambdaDNAHindIIIMarker.eng.ed.06March14.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=Vx8XmlrlvzM
Phage Lambda DNA / Hind iii digest ready-to-use
Agaróz gél elektroforézist fogunk végezni.
Protokoll:
2% Agaróz gél:
2 ml 50x TEA buffer
98 ml víz
2 g agaróz
Melegítsük a mikróban amíg fel nem forr és feloldódik az agaróz (2x
30s). Figyelem: csak papírkendővel fogjuk meg az üveget, mert forró és
a gőze is éget!
https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0012995_GeneRuler_100bp_DNALadder_50ug_UG.pdf
Várjuk meg amíg k.b. 60C-ra hűl
Adjunk hozzá 10 ul GelStar™ Nucleic Acid Gel Stain-t, amit korábban kiolvasztottunk.
Öntsük ki a gélt. Vigyázzunk, hogy lehetőleg minél kevesebb buborék képződjék és a berakott fésűt ellepje a gél.
Amikor a gél megszilárdult, öntsünk rá egy kevés TEA buffert és nagyon
óvatosan távolítsuk el a fésűt. Helyezzük a gélt a futtató kamrába és
töltsük fel a kamrát TEA bufferrel. A gélt csak nagyon vékonyan lepje
el a buffer,
Töltsük fel a zsebeket az előre elkészített mintákkal (10 ul / zseb)
Töltsünk még egy kevés buffert a kamrába, hogy a folyadék k.b. 1-2 mm-re ellepje a gélt.
Csatlakoztassuk a vezetékeket és kapcsoljuk be az áramforrást (k.b. 100
mA, k.b. 100V). A DNS a negatívtól a pozitív elektróda felé vándorol.
Az elektroforézis előrehaladása követhető a színmarkerek vándorlása
alapján (sárga elől, kék hátul)
A futtatás után UV átvilágítóval vizsgáljuk meg az eredményt. Figyelem:
Az UV fény vakságot okozhat, csak a műanyag védőlemezen keresztül
vizsgálhatjuk meg a gélt!!!! Fényképezzük le, a jegyzőkönyvben
elemezzük az eredményt (milyen csíkokat látunk, a létrával
összehasonlítva a csíkok mekkora méretű DNS-nek felelnek meg, ez
megfelel-e a várakozásnak?).
Minták:
1) GeneRuler 1 kb DNA Ladder, ready-to-use 12 ul
2) GeneRuler 100 bp DNA Ladder 3 ul
6X TriTrack DNA Loading Dye 3 ul
TEA buffer
6 ul
3) Lambda DNA HindIII digest 5 ul
6X TriTrack DNA Loading Dye 3 ul
TEA buffer
4 ul
4) Lambda DNA HindIII digest 5 ul
FastDigest EcoRI
2 ul
10X FastDigest Green Buffer 2 ul
víz
3 ul
5) Lambda DNA HindIII digest 5 ul
T4 DNA Ligase
2 ul
10X T4 DNA Ligase Buffer 2 ul
víz
3 ul
6... etc) Bármi, ami zöld... tárolt PCR termékek árpa HSDR4, etc.
2) PCR - DNS kivonás árpából / búzából
Kellékek:
Lysis puffer készítése
Törzsoldatok:
1M NaOH - 0,4 g NaOH 10 ml d.v.
1M NaCl - 0,58g NaCl 10 ml d.v.
1M TRIS - 1,576g TRIS 10 ml d.v.
Lysis puffer: Feloldunk 0,074 g EDTA-t 1 ml 1M NaOH-ban, Hozzáadunk 1ml 1M NaCl-t, kiegészítjük 10 ml-re d.v.-zel.
DNS kivonás:
1,5 ml-es eppendorf csőbe bemérünk 200 ul Lysis buffert, 60C-os
vízfürdőbe helyezzük, belemérünk 0,02 g levelet, 60C-on tartjuk 5
percig.
Szétdörzsöljük a leveleket
10 percig 60C-on inkubáljuk
20 ul 1M TRIS-t adunk hozzá
10 s-ig vortexeljük
6 percig centrifugáljuk
A felülúszóból 90 ul-t egy másik eppendorfba teszünk és hozzáadunk 90 ul (hideg!) isopropanolt
30 s ig vortexeljük
4 percig centrifugáljuk
A felülúszót leöntjük
50 ul d.v.-ben feloldjuk a DNS-t
PCR
25 ul Master Mix (green)
5 ul Forward primer (10x higított!)
5 ul Revers primer (10x higított)
5 ul DNS
Kiegészítve 50 ul-re d.v.-el
3) Alma ecet készítése
Video - Magyarázzuk el, mi történik
Elolvasni Mikrobiológia 1: 5-14. oldal
Elolvasni: 5 - 23 oldal
4) Plasmid izolálás, enzimatikus hasítás
Olvasni: DH5-Alpha sejtünk van, ami PKSS
plazmidot tartalmaz. Miért tenyésztjük ezt a törzset Ampicillin
jelenlétében? Mi történik (milyen fragmensek keletkeznek), ha ezt a
plazmidot ECoRI és HINDIII restrikciós enzimekkel hasítjuk?
Segítség: https://www.addgene.org/39272/sequences/ és https://nc2.neb.com/NEBcutter2/
Plazmid izolálás
Csináljuk meg a következő gyakorlatot.
5) RAPD módszer - genetikai ujjlenyomat
Olvasni:
http://www.nbpgr.ernet.in/Portals/6/DMX/GENOMIC_RESOURCES/PCR%20amplification%20assays-RAPD.pdf
https://en.wikipedia.org/wiki/Random_amplification_of_polymorphic_DNA
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrflp/
Feladat: Jellemezze és hasonlítsa össze (előnyök/hátrányok) a restrikciós térképezést és a RAPD módszert!